Episcopia, obiettivi LWD, stack, elaborazioni 3D

[Enotria]

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Avevo trascurato questo Forum per la difficoltà, per me, di procurarmi i soggetti delle vostre attenzioni: i ragni.

 

I miei interessi ruotano attorno alla microscopia ottica, un campo che a ben pensarci interessa anche voi, viste le dimensioni dei vostri soggetti.

 

Ed allora proviamo a parlare di tecnica microscopica, solo che non potendo io trattare direttamente i ragni, mi metto in un angolino del vostro Forum, le discussioni Off Topic, e provo a discutere di microscopia ottica: voi fate finta che sotto ai miei microscopi vi siano dei bellissimi ragni.

 

Spero che il discorso che faremo sia ugualmente interessante.

 

 

 

 

Episcopia, obiettivi LWD, stack, elaborazioni 3D

Quante parole complicate: eppure sono tutte legate fra di loro e, anche se non sembra, a loro volta sono tutte collegate alla microscopia.

 

Episcopia: letteralmente "guardare illuminando da sopra", esattamente alla rovescia di quello che facciamo noi normalmente, quando con il microscopio guardiamo un vetrino.

In genere il vetrino viene illuminato da sotto e noi guardiamo la luce che lo ha attraversato (diascopia), invece in questo caso la luce lo colpisce, ma senza riuscire ad attraversarlo, e la luce che noi vediamo al microscopio, è quella che viene riflessa dal campione.

Ed a cosa ci serve ?

Bé, è un modo diverso e più naturale di osservare, non occorre rendere trasparenti i soggetti, non serve colorarli, li si vede così, come realmente sono.

Facciamo un esempio reale: ho trovato in giardino un funghetto, nella mia ignoranza penso sia un Pisolithus ma, per sicurezza vostra, ne posto una foto al naturale:

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Le immagini episcopiche danno molto bene l’idea di queste isole di spore, separate dal micelio, che attendono di maturare, per poi diffondersi.

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Naturalmente, questo tipo di immagini sono le stesse che voi potreste vedere con l’utilizzo di una lente o di un buon microscopio stereoscopico, ma non lasciatevi ingannare, lo stereo al massimo vi mostra immagini ingrandite fino a 50 volte, poi deve gettare la spugna perché le sue ottiche non sono in grado di andare oltre.

 

Nel nostro caso, l’episcopia che voglio mostrarvi è in grado di raggiungere ingrandimenti anche molto elevati e vedremo in seguito in quale modo.

Per ora accontentiamoci di un modesto ingrandimento di 125x complessivi, con in bella mostra gli ammassi sporali, le fibre del micelio ed il tutto al naturale, senza coloranti ne conservanti !

 

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Facciamo ora un ulteriore passo avanti nell’ingrandimento, ma ancora senza forzare, senza utilizzare l’immersione omogenea in olio ed arriviamo a visualizzare le singole spore a 630x ingrandimenti complessivi.

Lavorando in episcopia ed a secco, la qualità della risoluzione non è certamente eccelsa, ma ci restituisce una immagine ancora abbastanza dettagliata ed intatta nei suoi colori naturali.

 

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Ma vediamo ora gli strumenti che ci sono necessari per questa tecnica: abbiamo già visto che lo stereo microscopio può fare ben poco, il suo limite di ingrandimento si ferma sui 40/50x complessivi, andare oltre è un suicidio fotografico.

 

Lo strumento giusto, c’è poco da fare, è il solito microscopio, magari con qualche avvertenza e qualche semplice accessorio.

 

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Come al solito utilizzo il mio “muletto”, lo Zeiss Standard WL, al quale ho aggiunto una basetta con un paio di led per illuminare in episcopia.

Potete notare come i led sono polarizzabili (lo uso anche per altre ricerche) e l’intera basetta è fissata al microscopio mediante alcuni magnetini al neodimio, in modo da essere facilmente smontabile.

 

A completare l’attrezzatura, una serie di obiettivi LWD (Long Working Distance), cioè di obiettivi che hanno una distanza maggiorata fra il soggetto e la loro prima lente. Questa caratteristica è indispensabile perché permette alla luce di illuminare l’oggetto, senza che il corpo dell’obiettivo faccia ombra, disturbando l’illuminazione.

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Questi obiettivi si trovano abbastanza facilmente sul mercato dell’usato ed, essendo poco conosciuti dalla maggior parte dei microscopisti, hanno un prezzo piuttosto basso. Nella foto, da sinistra, vedete un Nikon 1,2x, un Vickers 4x, un Leitz 10x ed un altro Leitz 32x, ma ve ne sono tanti altri, anche ad alto ingrandimento ed anche di adatti a lavorare in immersione oleosa.

 

 

 

Ma veniamo ora alla parte difficile, il Problema dei problemi nella episcopia: la scarsa profondità di fuoco.

Con più noi aumentiamo l’ingrandimento dell’immagine del nostro campione, con meno è ampia la zona che noi vediamo a fuoco.

 

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Ad esempio, in questo caso sto guardando dei licheni ma, a questo ingrandimento, risulta a fuoco solo il piccolo apotecio e neppure tutto.

L’unico modo che abbiamo per riprendere tutto a fuoco è quello di operare uno stack (catasta), quindi fare diverse foto, ciascuna mettendo a fuoco piani diversi ad altezze diverse. Inizieremo fotografando le parti più alte del soggetto, poi diminuiremo il piano a fuoco di pochi micron per fare la successiva foto e così via fino ad arrivare sotto alla zona che vogliamo rappresentare.

Alla fine, un particolare software di focus stacking elaborerà tutte le immagini della catasta, prendendo da ciascuna solo la parte nitida e unendole in una unica immagine, in cui tutti i punti saranno perfettamente a fuoco. O quasi !

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Per ottenere buoni risultati occorre che il dislivello fra un piano e l’altro sia sempre regolare e che il numero delle sezioni sia sufficiente per avere una buona omogeneità, senza zone ancora sfuocate.

Nella foto mostrata sopra vedete che non sono stato per niente bravo, infatti la parte più bassa del soggetto è stata dimenticata, di conseguenza gli apoteci in alto a sinistra, sono in parte sfuocati.

Riproviamo con un’altra immagine e cercando di fare qualche foto in più:

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Questo stack è venuto molto meglio, gli organi fruttiferi sono ben focalizzati e la leggera sfocatura del più alto, a sinistra e del più basso, al centro, conferisce un certo senso di profondità alla immagine, rendendola così più naturale, meno artificiosa.

 

Una volta che siamo riusciti ad avere delle buone immagini in episcopia, con tutto il soggetto a fuoco, possiamo continuare con una tecnica che, se ben applicata, è molto spettacolare. Stiamo parlando della elaborazione tridimensionale (3D) delle nostre fotografie.

Durante l’operazione di focus stacking il computer memorizza ogni punto con tre coordinate x,y e z, l’altezza di fuoco. Questo ultimo dato viene memorizzato in attesa di procedere ad ulteriori elaborazioni di tipo tridimensionale, in cui si suppone che l’oggetto ruoti ogni volta di un certo angolo e il software ricostruisce le diverse posizioni dei vari punti a fuoco rilevati.

Il risultato di tutto questo è un breve filmato in cui si vede la nostra immagine che lentamente si muove, ruotando su se stessa e mettendo così in mostra il dislivello dei vari punti fra loro. L’effetto è molto suggestivo e, realmente, permette di capire la posizione che i vari oggetti hanno nello spazio:

 

http://youtu.be/Re6k2pWl4fw?list=UUN2tYybGVfSxPG2M8QtRzrQ

 

 

Come vedete, abbiamo parlato di tecniche di microscopia che non riguardano espressamente il mondo degli aracnidi, ma che possono venire utili anche nel vostro campo.

Spero mi perdoniate la forzatura!

 

 

[Gaborri]

Grazie mille!!