analisi genetiche, come?

[AnDrO]

Ciao a tutti, come da titolo, mi chiedevo in quale modo vengono effettuate in genere le analisi genetiche sugli aracnidi. Il dna viene prelevato da campioni di tessuto, oppure direttamente dall'emolinfa? Mi riferisco sia ai ragni, che agli scorpioni, solifugi ecc... insomma, in generale. Vi ringrazio .

[AnDrO]

nessuno ne sa proprio niente?

[ivo]

mah... io credo proprio che il DNA (se qualcuno lo analizza) venga preso da un pelo, alla fine è la modalità più semplice, in fondo il DNA è codificato quasi d'appertutto, sbaglio?

[00xyz00]

Volevo rispondere giorni fa ma poi non ho avuto tempo.

Vediamo di chiarire le domande venute fuori.

 

La questione è molto semplice anche se sembra un metodo avanzato. In realtà di avanzato c'è il metodo analitico con cui si analizzano (appunto) i dati estratti.

Ad ogni modo, partiamo dal principio: si prende il ragno vivo o appena morto, gli si stacca una zampa e la si conserva in alcol assoluto, puro o comunque a 96° mantenendo la fialetta in congelatore. Questa è la situazione ottimale per non far degenerare il dna, il quale con il caldo, con l'acqua o con le sostanze che aumentano in concentrazione durante la marcescenza si rompe e quindi diventa con il tempo inutilizzabile.

 

A noi non interessa il dna nucleare, ma quello mitocondriale ovvero il mtDNA. http://it.wikipedia....A_mitocondriale

All'interno dei mitocondri questo dna particolare ha funzione di costruire determinate proteine/enzimi ed essendo svincolato dal dna nucleare si è visto che varia con una certa rapidità, di cui si conosce la variabilità media, e che è generalmente differente tra specie diverse e praticamente costante all'interno della stessa specie. Lo si è quindi considerato utile per questioni genetiche inerenti la posizione tassonomica di un gruppo rispetto all'altro. In particolare si è identificato il CO1, ovvero la prima subunità del citocromo c ossidasi (circa 600 basi), come marcatore molecolare di riferimento.

Come si fa?

Si prende la zampa di ragno, la si frulla(o la si congela per poi triturarla) e la si immette in un macchinario che, più o meno automaticamente, purifica, fa precipitare gli acidi nucleici, amplifica con un primer quelli che si vogliono analizzare e alla fine li sequenzia. Il processo è denominato barcoding. Il risultato è una lunga sequenza di basi.

 

Ecco un esempio per un esemplare di Hogna radiata spagnolo

 

 

 

Locus: Cytochrome Oxidase Subunit 1 5' Region

Nucleotides: 1000 bp

ATATCATTTCCTCGAATAAATAATCTTTCTTTTTGATTATTACCACCTTCTTTGTTCTTATTATCTATGTCTTCT

ATAGTGGAAATAGGAGTAGGGGCTGGTTGAACTGTTTATCCTCCTTTGGCTTCAAGAATGGGACATATAGGAAGT

TCTATGGATTTTGCTATTTTCTCTCTTCATTTAGCTGGAGCTTCTTCTATTATAGGGGCAGTTAATTTTATTTCT

ACGATTATTAATATACGTATAATGGGAATATCTATAGAGAAGGTTCCTTTATTTGTATGATCGGTGTTAATTACT

GCTATTTTATTATTACTTTCTTTACCTGTGTTAGCAGGTGCAATTACTATGTTGTTAACAGATCGAAATTTTAAT

ACTTCTTTTTTTGATCCGGCTGGAGGAGGTGATCCTGTTTTATTTCAACATTTGTTTTGGTTTTTTGGTCATCCT

GAGGTTTATATTTTAATTCTTCCTGGATTTGGAATTGTGTCTCATGTTATTAGTTCTTCAGTAGGTAAGCGAGAG

CCTTTTGGAAGATTAGGAATGATTTATGCTATAGTTGGGATTGGTGGAATGGGATTTGTTGTTTGAGCTCATCAT

ATGTTTTCTGTGGGAATAGATGTGGATACTCGTGCTTATTTTACTGCTGCTACTATAATTATTGCTGTACCTACT

GGTATTAAGGTTTTTAGATGAATAGCTACTATTCATGGATCTTATTTTAAGATAAATACTCCGTTGATATGAAGT

ATTGGATTTGTGTTTTTATTCACTTTAGGAGGAATTACTGGAGTGGTTTTATCTAATTCATCTTTGGATGTAGTT

TTACATGATACTTATTATGTAGTAGCTCATTTTCATTATGTGTTAAGAATAGGGGCGGTTTTTGCTATTTTAGCT

GGGATTACTTATTGATTTCCTTTATTTTTTGGTGTTATTTTAAGAGAAAAAATGACTAAGTTACATTTTTATGTG

ATATTTATTGGAGTTAATTTAACTT

Amino Acids:

MSFPRMNNLSFWLLPPSLFLLSMSSMVEMGVGAGWTVYPPLASSMGHMGSSMDFAIFSLHLAGASSIMGAVNFIS

TIINMRMMGMSMEKVPLFVWSVLITAILLLLSLPVLAGAITMLLTDRNFNTSFFDPAGGGDPVLFQHLFWFFGHP

EVYILILPGFGIVSHVISSSVGKREPFGSLGMIYAMVGIGGMGFVVWAHHMFSVGMDVDTRAYFTAATMIIAVPT

GIKVFSWMATIHGSYFKMNTPLMWSIGFVFLFTLGGITGVVLSNSSLDVVLHDTYYVVAHFHYVLSMGAVFAILA

GITYWFPLFFGVILSEKMTKLHFYVMFIGVNLTX

 

 

 

Bene. Ottenuto questo non si è risolto ancora nulla. Infatti questo "codice" è strettamente personale, appartiene univocamente a quell'esemplare di Hogna radiata. Se si fa il barcoding ad un altro esemplare si ottiene un codice diverso.

 

Ad esempio questo di un esemplare italiano

 

Locus: Cytochrome Oxidase Subunit 1 5' Region

Nucleotides: 1000 bp

AGTTTATTAGGTGATGATCATTTATATAATGTTATAGTTACTGCACATGCTTTTGTTATAATTTTTTTTATAGTT

ATACCAATTCTTATTGGTGGATTTGGGAATTGATTAGTTCCTTTAATATTAGGGGCTCCTGATATATCGTTTCCT

CGAATAAATAATCTTTCTTTTTGATTATTACCACCTTCTTTGTTTTTATTGTCTATATCTTCTATAGTAGAAATA

GGAGTAGGGGCTGGTTGAACTGTTTATCCTCCTTTGGCTTCAAGAATAGGGCATATAGGAAGTTCTATGGATTTT

GCTATTTTTTCTCTTCATTTAGCTGGAGCTTCTTCTATTATGGGAGCAGTTAATTTTATTTCCACAATTGTTAAT

ATACGAATAATGGGAATGTCTATAGAAAAGGTTCCTTTATTTGTATGATCAGTATTAATTACTGCTATTTTATTA

TTACTTTCTTTACCTGTATTGGCAGGTGCAATTACTATGTTGTTAACAGATCGAAATTTTAATACTTCTTTTTTT

GATCCGGCTGGAGGAGGTGATCCTGTTTTATTTCAACATTTATTTTGATTTTTTGGTCATCCTGAGGTTTATATT

TTAATTCTTCCTGGATTTGGAATTGTGTCTCATGTTATTAGTTCTTCAGTAGGTAAACGAGAGCCTTTTGGAAGA

TTAGGAATGATTTATGCTATAGTTGGGATTGGTGGAATAGGATTTGTTGTTTGAGCTCATCATATGTTTTCTGTA

GGAATAGATGTAGATACTCGTGCTTATTTTACTGCTGCTACTATAATTATTGCTGTACCTACTGGTATTAAGGTT

TTTAGATGAATAGCTACTATTCATGGGTCTTATTTTAAGATAAATACTCCGTTAATGTGAAGTATTGGATTTGTA

TTTTTATTTACTTTAGGAGGAATTACTGGGGTGGTTTTATCTAATTCATCTTTAGATGTGGTTTTACATGATACT

TATTATGTAGTGGCTCATTTTCATT

Amino Acids:

SLLGDDHLYNVMVTAHAFVMIFFMVMPILIGGFGNWLVPLMLGAPDMSFPRMNNLSFWLLPPSLFLLSMSSMVEM

GVGAGWTVYPPLASSMGHMGSSMDFAIFSLHLAGASSIMGAVNFISTIVNMRMMGMSMEKVPLFVWSVLITAILL

LLSLPVLAGAITMLLTDRNFNTSFFDPAGGGDPVLFQHLFWFFGHPEVYILILPGFGIVSHVISSSVGKREPFGS

LGMIYAMVGIGGMGFVVWAHHMFSVGMDVDTRAYFTAATMIIAVPTGIKVFSWMATIHGSYFKMNTPLMWSIGFV

FLFTLGGITGVVLSNSSLDVVLHDTYYVVAHFHX

 

 

E allora a che servono se sono tutti diversi? Qui entra in gioco la raffinatezza del metodo d'analisi, un metodo prevalentemente statistico.

Come ho detto prima questa sequenza (il gene del citocromo ossidasi appartenente al dna mitocondriale ) varia lungo il tempo geologico molto rapidamente cosi che specie diverse avranno una sequenza marcatamente differente mentre esemplari della stessa specie avranno una differenza molto piccola. Una specie si differenzia dall'altra con tempi solitamente lunghi quindi, in questo tempo, tra le due specie, il gene è potuto mutare di una bella quantità. Esemplari della stessa specie hanno invece progenitori troppo recenti per avere differenze sostanziali nel citocromo ossidasi 1.

 

Come in tutti i problemi statistici, con due esemplari come le nostre Hogna radiata non ci si fa nulla. Potremmo vedere con un software che i due codici riportati differiscono dello 0.89%. Questa informazione non ci dice niente.

 

Se però individuassimo un gruppo di esemplari di Hogna radiata, diciamo 50 esemplari di popolazioni diverse, e li individuassimo mediante criteri morfologici( tassonomia classica), non genetici, potremmo scoprire analizzandoli tutti, sequenziano i loro dna mitocondriali, che tra esemplare ed esemplare ci sono differenze dello 0.70 - 0,95% (è un esempio )

Avremmo capito che all'interno di questa specie la differenza del CO1 non supera l'1%, con una differenza media del 0,82%

E ci siamo quasi.

 

Se domani troviamo un esemplare che per caratteri morfologici è molto simile a Hogna radiata ma ne differisce un po', che mostra qualche carattere inaspettato, potremmo rivolgerci subito all'analisi genetica. Si prende il ragno, si estrae la sua sequenza CO1 e la si confronta con quelle che già avevamo ricavato. Confrontandole scopriamo che differiscono di un 4,7%!

Ecco, questo ci fa capire che l'esemplare che abbiamo trovato differisce molto di più che dell'1% e che quindi non appartiene alla specie H.radiata avendo un citocromo c ossidasi 1 troppo diverso!

 

 

Questo metodo di analisi lo si applica anche a generi e famiglie sebbene le cose diventino molto più complicate. Infatti la percentuale di variazione tra specie e specie, tra genere e genere, non sono valori omogenei. Si sono ad esempio specie in cui ogni individuo ha differenze del 2-3% rispetto ad un altro individuo della stessa specie. Ci sono anche generi che hanno differenze con altri generi molto ridotte, differenze che in altre famiglie troveremmo a livello di specie diverse (sempre pochi punti percentuali).

 

L'importanza di questo metodo ha fatto si che si venisse a costituire un database dei barcoding delle specie sequenziate a livello mondiale. Un database consultabile e quindi utilizzabile per confronti diretti.

Io posso sequenziare il CO1 del mio esemplare non ben identificato di Araneus sp., andare a confrontarlo con i barcoding effettuati per le specie papabili (A.diadematus, A.angulatus, A. pallidus...) e vedere la loro differenza reciproca. In base a questa potrei vedere che il mio esemplare è molto distante da A.diadematus e A.pallidus ma molto vicino ad A.angulatus. E il gioco è fatto. A patto di aver fatto confronti con un numero statisticamente rilevante di campioni!

 

 

L'analisi genetica e molecolare non è solo questo ovviamente. Ad esempio analizzando alcuni geni il cui tasso di mutazione è circa costante si può capire, confrontando due specie, quando queste hanno iniziato a differenziarsi dal progenitore comune. Si può quindi usare per stilare alberi filogenetici o cercare di intuire, nota l'epoca dei fatti, le cause per cui le due specie si sono differenziate (rapidi cambiamenti climatici, barriera geografica od ecologica ormai non piu esistente...) E molti altri usi se ne fanno e se ne faranno.

 

Le potenzialità sono tante ma non può diventare una semplificazione eccessiva, una riduzione ai minimi termini della sistematica classica. Se non si hanno gruppi individuabili morfologicamente da prendere come elemento di confronto, le cose potrebbero non tornare più e la confusione sarebbe immediata. L'analisi molecolare è piu uno strumento tecnologicamente avanzato, insieme all'analisi cladistica e morfologica, per capire i rapporti di parentela tra specie diverse e delimitarne i campi di variabilità.

Presa da sola è poco utile.

 

P.S. Le mie sono conoscenze da semplice appassionato. L'argomento è vasto, molto tecnico e sicuramente non ho scritto tutto quello che c'è da dire sulla questione. Se ho fatto errori pregherei utenti e visitatori più competenti di correggermi. Ogni aggiunta sarà oltremodo gradita.

[filippo]

Non posso aggiungere niente di concreto...se non un link al sito dell' NCBI, dal quale è possibile consultare diversi database e reperire innumerevoli informazioni inerenti genomica e biomedicina. Penso che a qualcuno potrebbe interessare

 

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/

[AnDrO]

scusate, mi ero perso gli sviluppi, grazie a tutti per le risposte , Carlo, sei andato oltremodo nel dettaglio! Ora, almeno a livello teorico, mi è più chiaro l'argomento!